经验丰富的妈妈们总是“独具慧眼”，看到准妈妈们的大肚子就忍不住热心地帮忙推断肚子里的宝宝是男是女……有人说，准妈妈的肚子尖尖生男生、肚子圆圆是女孩，到底如何能够“慧眼识男女”呢?
说法1：胎儿心率低于140次/分，则所怀胎儿是男孩
解析：女孩心率比男孩高，这只是在刚出生时是对的，胎儿的心率就男孩和女孩之间没有任何差别。心率的快慢只是随胎龄的不同而变化。在约孕5周时，胎儿的心率与妈妈的心率接近，即80~85次/分。然后到孕9周这段时间内心率逐渐加快至170~200次/分。尔后到孕中期这段时间内又逐渐放慢至 120~160次 /分。
说法2：孕妇腹部突出过大是女孩，腹部不太突出或下腹部突出为男孩
解析：如果孕妇上身短，胎儿发育的空间只能向外延伸，所以腹部会显得很大。
反之，孕妇上身长，可为胎儿发育提供足够的空间，腹部就无须向外突出。
说法3：孕妇下怀(下腹部大)是男孩，上怀(上腹部大)是女孩
解析：如果孕妇是上怀，那可能是第一次怀孕或孕妇的体形好。当孕妇怀过一次孕以后，腹部肌肉松弛，再次怀胎时自然也就“下垂“了。
说法4：乳头发黑是男孩
解析：乳头颜色受到体内激素的影响，孕期体内黄体酮和刺激黑色素细胞的激素水平的增加，导致体表面某些原本发黑的部位更黑，当生完孩子后就会很快恢复，这种现象与胎儿性别毫无关系。
说法5：吃酸吃碱与生男生女的关系
解析：有人仅凭味道来确定食物是酸性还是碱性，这本身就是一种错误认识。需要强调的是，人体出现酸碱不平衡的状态，通常是患病所致。
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孕妇血浆中胎儿DNA的提取及STR基因的检测
作者：李维春 武荣 倪月 周春雷 作者单位：239000 滁州 安徽医科大学滁州临床学院
【摘要】 目的 探索在孕妇血浆中提取胎儿DNA及STR基因的检测方法。方法 提取10名健康孕妇(12～40周)血浆标本中胎儿游离DNA，对15个短串联重复序列（short tandem repeat，STR）基因位点和1个性别Amelogenin基因进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。同时，检测孕妇及其丈夫的基因组DNA，进行对照研究。结果 经性别Amelogenin基因的检测，与胎儿实际的性别符合率为100%。经STR-PCR检测发现，所有10例孕妇血浆中均检测出父源性胎儿DNA的存在，检测数量为2.89±1.62。结论 本实验采取的方法准确性较高，可作为符合国家法律规定范围内的一种无创性的产前诊断方法。
【关键词】 聚合酶链反应；短串联重复序列；产前诊断
Extraction of fetal DNA in maternal plasma and detection of short tandem repeat gene
Li Weichun，Wu Rong，Ni Yue，et al
Chuzhou Clinical Institute of Anhui Medical University,Chuzhou 239000，China
［Abstract］ Objective To explore the methods of extracting fetal DNA in maternal plasma and detecting STR gene.Methods The DNA templates was extracted by QIAamp Circulation Nucleic Acid Kit from 10 maternal(12-40weeks)plasma.Multiplex polymerase chain reaction was amplified at fifteen different short tandem repeat(STR) loci and one Amelogenin gene. At the same time, testing pregnant women and their husbands genomic DNA, for control study.The results were confirmed by examination of newborns after delivery.Results The concordance rate between real fetal sex and sex determined by amplification of the Amelogenin gene was 100%(10/10).The paternally inherited fetal alleles were detected by STR detection in all cases.Conclusion In this study, the approaches taken in the higher accuracy can be used as non-invasive prenatal diagnosis methods.
［Key words］ Polymerase chain reaction；Short tandem repeat ;Prenatal diagnosis
目前,传统的产前诊断是建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞遗传学诊断，虽然诊断准确，但因其操作有创伤性，易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿有一定的影响。提取孕妇血浆标本因无需穿刺，对胎儿无任何创伤、可在妊娠早期诊断等优点，倍受围生医学和法医学的关注，本文应用QIAamp Circulation Nucleic Acid Kit进行孕妇血浆中胎儿游离DNA的提取和STR等位基因检测的研究，积累相关的DNA的提取和检测经验，现报告如下。
1 对象和方法
1.1 对象
选择2009年2月至10月在我院产科就诊，妊娠12～40周的健康孕妇10例，经医院伦理委员会批准，并签订测试者知情同意书。采集孕妇静脉血6 ml，5%EDTA抗凝，先1 600 g离心10 min，分离血浆后再经16 000 g离心10 min［1］。收集上清血浆置于-20℃保存备用。同时，使用无菌纱布分别采集孕妇及其丈夫全血40 μl，4℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器
QIAamp Circulating Nucleic Acid Rit(德国QIAGEN，货号55114)；Taq酶（美国Promega），PowerPlex 16 System检测试剂盒（美国Promega）；分子量内参标准物ILS600（美国Promega）；Chelex-100(美国Sigma公司)；ABI9700扩增仪及ABI3130xL型基因测序仪。
1.2.2 血浆DNA提取
采取QIAamp DNA提取试剂盒对10例孕妇2 ml血浆进行总DNA提取，操作按照使用手册进行，每例最终获得DNA缓冲液70 μl，于4℃保存；采用Chelex-100提取孕妇及其丈夫基因组DNA，分别获得50μl DNA提取液，4℃保存。
1.2.3 孕妇血浆胎儿STR基因位点和性别决定基因PCR扩增
分别以10例孕妇血浆总DNA和孕妇及其丈夫基因组DNA为模板，对15个STR等位基因和1个性别决定基因进行STR-PCR扩增。PCR的反应体系为25 ul,含Primer Pair Mix 2.5 μl,Buffer 2.5 μl,Taq酶0.75 μl,H2O16.75 μl,DNA 2.5 μl.PCR循环条件为：94℃ 3 min，94℃ 30 s、57℃ 35 s、72℃ 1 min，共35个循环。
1.2.4 扩增产物分析
扩增产物在ABI3130xL基因测序仪上进行扫描（分子量内参考标准物为ILS600），使用Gene Mapper ID 3.2软件进行分析。
1.2.5 父源性胎儿等位基因的判定
将孕妇血浆DNA的STR基因峰图谱分别与孕妇丈夫基因DNA的STR基因峰图谱及孕妇基因DNA的STR基因峰图谱相比较，若在孕妇血浆DNA的STR基因图谱中检测到了“丈夫”的STR基因峰，而孕妇基因组DNA中无此基因峰，则证明检测出胎儿父源性的等位基因。
2 结果
2.1 10例孕妇血浆胎儿Amelogenin等位基因的检测
10例孕妇血浆中，检测出Y等位基因4例，未检测出Y等位基因的6例，与出生后随访的胎儿性别一致，性别符合率100%。
2.2 STR等位基因位点的检测结果 本文10例孕妇血浆中均检测到父源性胎儿等位基因，检出胎儿父源性等位基因数量为1～6个，平均为2.89±1.62。孕妇血浆DNA的STR基因峰（图1A）与孕妇丈夫基因DNA的STR基因峰（图1B）及孕妇基因DNA的STR基因峰（图1C），具体比较结果见图1。
3 讨论
目前，DNA的提取方法有许多，包括直接加热煮沸法、酚-氯仿提取法和磁珠吸附法，但若用于本来浓度较低的胎儿游离DNA提取，往往造成假阴性。Bischoff等［2］报道胎儿DNA占孕妇血浆中总DNA的5%～7%。而大量母体DNA可能会影响胎儿游离DNA的检测。因此，如何富集到高浓度和高纯度的DNA是本研究关键的。Lam等［3］研究证实，如在6 h内，使用EDTA和肝素、枸橼酸钠抗凝效果无显著差别，而血样放置6 h后，EDTA的抗凝效果优于肝素和枸橼酸钠，因此，大多数学者选择EDTA抗凝。李勤等［4］研究发现随着孕妇血浆放置时间的延长，母体白细胞开始死亡并不断释放细胞内容物使血浆总游离DNA含量升高从而引起胎儿游离DNA浓度的相对降低。另一方面，血浆中的DNA酶也会不断降解胎儿的游离DNA，使胎儿DNA不断减少。本实验血液采集后，一般尽早分离血浆，多在6 h内。如果不能及时分离血浆，应置4℃冰箱保存。孕妇血浆采取两次离心获得，先用1 600 g低速离心，然后再经16 000 g高速离心，因为初次离心速度过快会导致母体细胞破坏溶解，从而导致母体DNA含量增加而胎儿游离DNA浓度的相对稀释［3］。而第2次高速离心主要目的是把血浆中的细胞沉淀分离出来。本文预实验使用全血DNA的提取和病毒、细菌DNA提取，均未获得成功。后来实验中采用德国QIAamp Circulation Nucleic Acid Kit用于血浆或血清DNA提取和纯化的试剂盒，选择适当的血浆分离程序、加大血浆用量、改真空抽提代替离心等改良方法，最终提取到高浓度和高纯度的DNA。
近年来，短串联重复序列（short tandem repeat，STR）,因其在人群中有高度的杂合性和多态性，不同的位点在人群中存在相同的基因型的概率很小，因此，可被广泛用于法医识别和亲子鉴定。孕妇血浆中胎儿的DNA主要为短片段的DNA，若DNA片段为100 bp时检出率为100%，193 bp时仅占20%，313 bp时未检出［5］。郑志辉等［6］通过扩增片段长度较小的（常见等位基因小于200 bp）、多态性丰富的miniSTR基因座，检测胎儿游离DNA，结果在D13S317等8个常染色体miniSTR基因座中，9例孕妇均检测到父源性STR等位基因，平均3.1个。本文对10例孕妇15个常染色STR等位基因检测，检出也是以短片段的STR基因位点为主，检出最高的为D3S1358，其次为vWA、D5S818、D8S1179，而DNA片段在250 bp以上的STR等位基因，如D18S51、D16S539、TPOX等未检出。因此建议选择小片段长度的等位基因进行STR位点检测。
本实验采取的方法，检测到了胎儿DNA，且准确性较高，可作为符合国家法律规定范围内的一种无创性的产前诊断方法。但由于本实验收集样本量较小，还有待于进一步扩大样本量做相关的研究，进一步验证本实验方法的准确性。
【参考文献】
［1］Chiu RWK，Poon LLM, Lau TK,et al.Effects of blood processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma.Clin Chem,2001,47:1607-1613.
［2］Bischoff FZ,Lewis DE,Simpson JL.Cell-free fetal DNA in maternal blood:kinetics,source and structure.Hum Reprod Update,2005,11:59-67.
［3］Lam NY,Rainer TH,Chiu RW,et al.EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis .Clin Chem,2004,50;256-257.
［4］李勤，张毅,丁宇峰,等.孕妇血样采集后体外存放对血浆中胎儿游离DNA水平的影响.第二军医大学学报, 2008,29(9):1042-1045.
［5］Chan KC,Zhang J,Hui AB,et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma.Clin Chem,2004,50(1):88-92.
［6］郑志辉,李茜,梁延连,等.MiniSTR技术应用孕妇血浆中胎儿游离DNA检测的研究.中国输血杂志，2008，21(7):489-501.
(责任编辑：竹)
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